【新藥進展】新發現一種口服小分子HBV cccDNA抑制劑

編者按：慢乙肝的完全治愈需要達到cccDNA和整合HBV DNA的清除，而現有抗病毒藥物均不直接作用于cccDNA或整合HBV DNA，慢乙肝的完全治愈暫時無法實現，慢性HBV感染仍然是一個全球性的公共衛生威脅。

2022年12月，羅氏上海創新中心的研究人員在Journal of Hepatology 雜志首次報道了靶向cccDNA的口服小分子抑制劑ccc_R08，其在細胞和小鼠模型中對cccDNA的強效抑制作用有可能為治愈HBV感染提供一種新的途徑。

研究方法

采用HBV感染的原代人肝細胞（PHHs）篩選新型cccDNA抑制劑，采用HBVcircle小鼠模型評估所發現的cccDNA抑制劑的抗HBV療效，通過正向和反向藥理學研究方法探討cccDNA抑制劑的作用機理。

研究結果

01 經高通量篩選鑒定出一種新型HBV cccDNA抑制劑

通過對HBV感染的PHHs進行高通量篩查，共篩選了84.6萬個小分子化合物。最終發現cccDNA抑制劑ccc_R08可劑量依賴性地降低細胞外HBV DNA、HBsAg、HBeAg水平以及細胞內HBV DNA和RNA水平，IC50值約為0.2 - 5 μM。為闡明ccc_R08的作用機制，從PHHs中提取Hirt DNA并使用Southern blot和real-time PCR法檢測cccDNA水平，發現ccc_R08在兩項試驗中均以劑量依賴性的方式顯著降低cccDNA水平。

ccc_R08的化學結構及對PHHs中cccDNA水平的影響

02 ccc_R08特異性抑制HBV，安全性良好

ccc_R08對來自不同組織的不同細胞系沒有明顯的細胞毒性。對HEp-2和HEK293細胞在內的多種細胞系的細胞增殖及細胞周期無明顯影響。

03 ccc_R08治療導致HBVcircle小鼠模型中血清HBsAg及pgRNA、肝內cccDNA水平持續降低

為了評估ccc_R08的體內療效，采用了一種創新的HBVcircle小鼠模型，該模型通過流體動力學注入細菌重組機制產生的cccDNA樣分子。HBVcircle小鼠可持續產生高水平的血清HBsAg。小鼠口服給予20 mg/kg的ccc_R08或媒介物每天兩次，持續2周。ccc_R08組血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平下降至最低水平且在停藥隨訪5周內維持低水平。隨訪結束時，小鼠肝臟中cccDNA水平檢測不到，表明cccDNA被清除。未觀察到藥物對小鼠體重的影響，表明ccc_R08對cccDNA的作用通過非細胞毒機制介導。

HBVcircle小鼠模型中ccc_R08的抗HBV活性

為研究ccc_R08是否可以降低循環中的pgRNA水平及其與cccDNA的相關性，HBVcircle小鼠每天兩次接受不同劑量的ccc_R08治療，持續42天，停藥隨訪14天。ccc_R08對血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA的抑制作用呈劑量依賴性。ETV治療導致HBV DNA顯著減少，但對HBsAg、HBeAg、pgRNA或cccDNA無明顯影響。相反，ccc_R08可劑量依賴性地顯著降低血清pgRNA水平，且不同劑量下pgRNA的減少與肝臟cccDNA的減少在數量上相關。此外，小鼠血漿ccc_R08濃度與HBsAg、HBeAg、HBV DNA和pgRNA的降低呈良好相關性。以上結果支持使用pgRNA作為血清生物標志物來代表肝臟中cccDNA的水平和轉錄活性。

HBVcircle小鼠模型中ccc_R08對血清pgRNA水平的影響

04 通過正向和反向藥理學探討ccc_R08的作用機理

在正向藥理學研究中，ccc_R08顯著降低了HBV基因的總表達量，對HBV轉錄調控呈時間依賴性；ccc_R08顯著調控了大量宿主基因，通過調節宿主基因的表達進一步抑制了HBV基因表達，提示其抗HBV作用很可能是通過調控宿主基因介導的。為了篩選可能導致ccc_R08誘導cccDNA減少的基因，共確定了67個既與HBV cccDNA潛在功能相關又受ccc_R08轉錄調控的基因。在反向藥理學研究中，分析確定了21個可能與ccc_R08作用方式相關的宿主蛋白，其中13個能削弱、8個能增強ccc_R08抑制cccDNA的能力。整合正向和反向藥理學結果構建生物網絡，發現其中四個基因ATM、CHEK1、CHEK2和TOP2A為化合物抑制HBV cccDNA的因果靶點，兩個參與細胞周期和轉錄的關鍵轉錄因子JUN和E2F1也可能受到ccc_R08的調控。ccc_R08對HBV cccDNA抑制作用的單一作用機制暫不明確。

肝霖君有話說

受感染肝細胞中cccDNA的持續存在是乙肝暫無法完全治愈的主要原因。小分子ccc_R08直接靶向cccDNA，在體外細胞和體內小鼠試驗中均顯著降低了cccDNA水平，有潛力作為未來治愈慢性HBV感染的一種新方法，但目前仍在臨床前研究階段，是否能在臨床研究階段表現出同樣的效力還有待考察。另外直接靶向cccDNA藥物是否能清除整合HBV DNA以及由此產生的HBsAg，這仍然是值得關注的（相關鏈接）。

在研的基因編輯類藥物能同時靶向cccDNA和整合HBV DNA，在治愈慢乙肝方面展現出了巨大潛力，但基因編輯藥物研發難度大，目前均處于臨床前研究階段。并且由于基因編輯效率問題和脫靶效應等，基因編輯藥物的開發也充滿挑戰（相關鏈接）。

總之，慢乙肝完全治愈道阻且長。在當前臨床治愈可以實現的前提下，患者可積極追求臨床治愈。研究發現，臨床治愈的患者中有27%可獲得cccDNA清除，整合HBV DNA顯著降低（相關鏈接），可能是最接近完全治愈的目標，同時可最低化遠期不良結局風險，顯著提高患者的生活質量。

參考文獻：

Wang L, Zhu Q, Zhang JD, et al. Discovery of a first-in-class orally available HBV cccDNA inhibitor. J Hepatol. 2022: S0168-8278(22)03466-3.

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