【期刊導讀】侯金林/李詠茵/唐利波教授團隊：干擾素α通過B細胞與T細胞的強化連接增強抗HBV特異性免疫應答

編者按：HBV的消除依賴于適應性免疫，慢乙肝（CHB）患者實現臨床治愈的一個可行途徑是通過免疫調節恢復乙肝病毒特異性免疫功能。干擾素α（IFN-α）對免疫系統具有廣泛的作用，包括增強樹突狀細胞和單核細胞的功能，促進B細胞活化和抗體類別轉換，以及在特定感染中差異塑造細胞免疫。目前IFN-α治療的總體臨床治愈率仍在不斷的優化策略中逐步提高，因此誘導最佳的適應性免疫機制在對抗HBV中至關重要。

IFN-α介導的T細胞重構對于實現CHB患者的最佳治療應答是必不可少的（相關鏈接）。而B細胞除了抗體的產生，還可通過遞呈抗原和提供共刺激信號，促進保護性T細胞應答。來自B細胞的細胞因子，如IL-6、IL-27、IFN-γ和TNF-α，在T細胞分化中也很關鍵。但是對B細胞在IFN-α介導的HBV特異性免疫中的作用知之甚少。

近期，南方醫科大學南方醫院的侯金林教授、李詠茵教授和唐利波教授團隊在Antiviral Research上發表了一項關于B細胞在IFN-α治療期間的作用研究，結果表明：B細胞耗竭會損害功能性T細胞亞群，包括HBV特異性CD8+ T細胞，并導致HBV清除延遲；IFN-α治療增強HBV特異性CD8+ T細胞的應答的潛在機制與PEG IFNα通過B細胞的抗原呈遞和共刺激功能增強B細胞與T細胞的連接有關。

研究方法

本研究納入南方醫科大學南方醫院6例未經治療的HBV感染患者和4例HBeAg陽性、接受聚乙二醇干擾素α（PEG IFNα）治療的患者。

分別利用患者血樣及μMT小鼠模型（B細胞缺陷小鼠）進行實驗分析：將pBlank質粒（空白對照）、pAAV/HBV1.2質粒（包含1.2倍全長A型HBV基因組）和pIFNα4質粒（使肝內IFN-α長期表達，并在小鼠模型中被證實具有有效的抗HBV作用）分別水動力注射在μMT小鼠模型中觀察B細胞對IFN-α介導的T細胞應答的影響；利用患者血樣進行單細胞RNA測序（scRNA-seq），分析B細胞和T細胞亞群之間的串擾，以及IFN-α治療的CHB患者縱向血樣中潛在的分子和通路特征。

研究結果

01

B細胞缺乏會阻礙HBV特異性細胞免疫應答

與野生型小鼠（WT）相比，缺乏成熟B細胞的μMT小鼠外周總CD4+ T細胞的頻率顯著增加，可能是由于B細胞亞群數量減少。脾臟中CD4+ T細胞以及外周和脾臟中CD8+ T細胞的頻率有所減少。在功能性T細胞亞群中，發現B細胞缺乏導致CD4+ T細胞和CD8+ T細胞中效應記憶T細胞（TEM）和中央記憶T細胞（TCM）的頻率減少。此外，與生發中心反應相關的濾泡輔助性T細胞（Tfh）和濾泡細胞毒性T細胞（Tfc）在μMT小鼠中的比例也整體下降。

在注射后的第28天和56天，μMT小鼠肝內CD8+ T細胞的頻率顯著低于對照組。同時，μMT小鼠肝內IFN-γ的產生減少，提示細胞毒性T細胞的功能減弱。因此，μMT小鼠的血清HBsAg、HBeAg、肝內HBcAg清除延遲，且不能產生血清抗-HBs。

不同小鼠模型的抗HBV細胞免疫應答

02

IFN-α介導的抗HBV應答具有B細胞依賴性

在體外使用PEG IFNα刺激CHB患者的外周血單核細胞（PBMCs），發現PEG IFNα的加入明顯誘導了CD19+ B細胞上CD69和CD86的表達。pIFNα4質粒已被證實在小鼠模型中具有有效的抗HBV作用，但在μMT小鼠中注射pIFNα4質粒后，血清HBsAg和HBeAg水平升高，說明IFN-α發揮抗HBV作用的B細胞依賴性。

作為一種多效性細胞因子，IL-21在促進B細胞生存、分化和功能方面具有顯著作用，且與CHB患者良好的治療結果相關。在質粒注射后的第30天，Il21r-/-小鼠（IL-21受體缺失）脾內和肝內漿母細胞大量減少，盡管IFN-α誘導的B細胞分化在Il21r-/-小鼠中仍存在，但與WT相比明顯減弱。此外，與對照組相比，注射pIFNα4的Il21r-/-小鼠HBV抗原清除能力仍保留，但有所減弱，提示IL-21參與了pIFNα4誘導的抗HBV作用，但并非完全必要。

B細胞和IL-21在IFN-α介導的抗HBV應答中的作用

03

IFN-α增強HBV特異性細胞免疫

在體外培養系統中觀察到IFN-α誘導T細胞亞群的分化和顆粒酶B的產生。與pBlank組相比，注射pIFNα4的WT小鼠脾內CD4+ T細胞擴增，其次是CD8+ T細胞。同時，pIFNα4注射后第20天誘導脾內HBV包膜特異性產生IFN-γ的CD8+ T細胞頻率顯著增加，注射后第10天和第20天檢測到肝內HBV核心特異性產生IFN-γ的CD8+ T細胞的頻率顯著增加，從而促使血清HBV DNA大幅降低。

IFN-α注射小鼠的抗HBV細胞免疫應答 ；C - F：用重疊肽刺激小鼠，檢測脾內和肝內IFN-γ+CD4+和IFN-γ+ CD8+ T細胞的頻率，這些重疊肽跨越HBV核心蛋白（core）、包膜蛋白（env）或總HBV蛋白（all）。

04

IFN-α增強的HBV特異性細胞免疫具有B細胞依賴性

在B細胞缺乏的情況下，pIFNα4組和pBlank組之間肝內HBV核心特異性CD8+ T細胞的頻率沒有差異，且在pIFNα4注射后第20天脾臟和肝臟中HBV特異性產生IFN-γ的T細胞沒有增加。提示B細胞在IFN-α誘導的抗HBV細胞免疫中不可或缺的作用。

B細胞缺失的情況下，IFN-α誘導的細胞免疫應答

05

在PEG IFNα治療過程中，B細胞介導的T細胞抗原呈遞增強

對接受PEG IFNα治療的HBeAg陽性CHB患者在0周、4周和12周收集的PBMCs進行scRNA-seq。擬時分析顯示，IFN-α治療能有效誘導T細胞向效應/記憶亞群的末端分化。

對差異基因（DEGs）進行分析，單核細胞、B細胞和T細胞中部分基因的表達在基線和治療后有明顯的差異，表明IFN-α治療引發了強烈的免疫調節。通過GO功能富集分析將B細胞或T細胞在治療第4周和12周時的表達譜與基線表達譜進行比較。在IFN-α處理后，B細胞中上調的DEGs富集在抗原處理和呈遞途徑，而T細胞的DEGs顯著富集在與細胞因子應答、免疫效應過程、T細胞激活和IFN-γ產生的相關通路中。

PEG IFNα治療的CHB患者適應性 免疫系統的單細胞測序擬時分析

B細胞或T細胞在治療第4周和第12周與基線；對比上調的DEGs GO富集分析

06

IFN-α顯著增強B細胞與T細胞的連接

利用CellPhoneDB和CellChat分析細胞間一般通信的縱向動態，B細胞亞群和CD8+效應亞群之間的通信明顯上調。使用ICELLNET分析B細胞向T細胞的通信，B細胞亞群與T細胞，特別是CD8+ T細胞，連接增強。同時，共刺激分子對的相互作用在IFN-α治療期間持續增強，表明B細胞發揮了抗原呈遞功能，以幫助T細胞免疫。

通過scRNA-seq分析PEG IFNα 治療過程中細胞間的縱向通信

肝霖君有話說

IFN-α以B細胞依賴的方式協調保護性HBV特異性細胞免疫，其潛在機制與由抗原呈遞和共刺激相互作用所介導的B細胞與T細胞的強化連接有關，表明了IFN-α在先天性免疫和適應性免疫調節上的獨有特征。已有數據表明PEG IFNα治療慢乙肝有利于重塑B細胞亞群（相關鏈接），并且可以通過濾泡輔助性T細胞刺激B細胞分化，促進HBsAg血清學轉換（相關鏈接）。也有研究證明了在HBV感染或其他病毒感染模型中B細胞增強CD8+ T細胞殺傷效應的途徑，強調“B - CD8+ T細胞”增強效應的有益結果。本研究結果表明，B細胞在IFN-α治療過程中參與細胞免疫方面具有不可替代的作用。B細胞缺失導致功能性T細胞亞群的應答受損，特別是在HBV感染背景下的CD8+ T細胞亞群。因此，以“IFN-α - B - T細胞”為靶點的潛在聯合療法可能有利于慢乙肝患者的治療療效。

參考文獻：

Zhong S, Li Q, Wen C, et al. Interferon alpha facilitates anti-HBV cellular immune response in a B cell-dependent manner[J]. Antiviral Res, 2022, 207: 105420.