【期刊導(dǎo)讀】最接近慢乙肝完全治愈的理想標(biāo)志物——高靈敏度定量HBsAg清除

編者按：臨床治愈（HBsAg清除）已成為國際認可的慢乙肝理想的治療目標(biāo)，大量臨床研究證實基于聚乙二醇干擾素α（PegIFNα）的抗病毒治療策略是慢乙肝臨床治愈的最佳選擇，核苷（NAs）經(jīng)治患者可實現(xiàn)30%-80%的臨床治愈率（相關(guān)鏈接），能顯著改善慢乙肝患者的遠期臨床結(jié)局，極大降低肝癌發(fā)生風(fēng)險（相關(guān)鏈接）。

在臨床治愈已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)的今天，完全治愈將是我們下一步努力奮斗的目標(biāo)。近期北京大學(xué)人民醫(yī)院封波教授團隊在JournalofClinicalandTranslationalHepatology上發(fā)表的最新文章就慢乙肝治療的發(fā)展、血清HBsAg的起源、清除模式以及HBsAg清除對免疫功能和疾病轉(zhuǎn)歸的影響進行了綜述，討論了高靈敏度HBsAg定量檢測的意義并首次提出了其作為慢乙肝患者完全治愈替代性標(biāo)志物的可能性。雨露肝霖將其中部分重點內(nèi)容與大家分享。

01 血清HBsAg的來源與降解

血清HBsAg來源于cccDNA和整合HBVDNA。cccDNA可以以轉(zhuǎn)錄不活躍的濃縮狀態(tài)或轉(zhuǎn)錄活躍的松弛狀態(tài)存在。cccDNA作為轉(zhuǎn)錄模板產(chǎn)生傳染性HBV病毒顆粒和非傳染性亞病毒顆粒（SVP）并釋放到血液中。整合HBVDNA是整合到肝細胞染色體不同部分的線性DNA，由于缺乏正常的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，整合HBVDNA只能表達S-和M-HBsAg。血液中約99.99%的HBsAg存在于SVPs中。對于獲得完全病毒學(xué)應(yīng)答或HBeAg陰性的慢乙肝患者，大多數(shù)血清HBsAg來自整合HBVDNA而非cccDNA。有轉(zhuǎn)錄活性的整合HBVDNA存在于整個肝臟并轉(zhuǎn)錄形成廣泛的HBsAg，該過程獨立于HBV復(fù)制。

受感染的肝細胞通過多種降解途徑調(diào)節(jié)HBsAg的分泌，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的蛋白水解和自噬。此外，蛋白酶體、泛素等的獨特的蛋白水解機制也參與了M-和L-HBsAg的降解。肝細胞的感染常伴隨著降解途徑活性的增強，表明血清HBsAg處于不斷更新中。

血清HBsAg來源于cccDNA和整合HBVDNA

02 持續(xù)血清HBsAg清除的流行病學(xué)和模式

自發(fā)性HBsAg清除的病例很少，每年僅約1%左右。一項包括1076例慢乙肝患者的臺灣研究顯示，10年和25年累積自發(fā)HBsAg清除率分別為8.1%和44.7%。自發(fā)血清學(xué)HBsAg清除與高齡、非亞裔種族、非活動性HBsAg攜帶狀態(tài)、HBV基因型A型、低HBVDNA水平以及HBsAg定量水平高度相關(guān)。

NAs抑制HBVDNA的復(fù)制而不直接作用于cccDNA，因此NAs很難阻止HBV顆粒及其抗原的產(chǎn)生。NAs治療獲得HBsAg清除的比例在3%以下。NAs治療下HBsAg清除的預(yù)測因素包括種族、HBV基因型和停藥時的病毒抗原水平。2021年亞太肝臟研究協(xié)會（APASL）制定了NAs停藥的相關(guān)指南，建議HBeAg陰性且HBsAg水平相對較低的患者停用NAs以獲得HBsAg清除。

雖然PegIFNα抑制HBVDNA復(fù)制的能力弱于NAs，但促進HBsAg水平下降的作用更顯著，PegIFNα單藥治療初治患者48周的HBsAg清除率為3-7%，而PegIFNα聯(lián)合NAs治療可進一步顯著提高HBsAg清除率，特別是對于NAs經(jīng)治的患者。隨著PegIFNα治療后停藥時間的延長，HBsAg清除率也持續(xù)增加，顯示出良好的延遲性。此外，在推薦抗病毒治療的非活動性HBsAg攜帶者中，PegIFNα誘導(dǎo)了較高的HBsAg清除率，特別是在基線HBsAg低水平的患者中。

03 持續(xù)血清HBsAg清除對免疫功能的影響

HBV感染是HBV與宿主相互作用的結(jié)果，免疫性肝損傷是乙型肝炎的主要發(fā)病機制。宿主產(chǎn)生的免疫應(yīng)答與慢乙肝自然病史以及急性HBV感染的結(jié)局密切相關(guān)。HBV相關(guān)抗原尤其是HBsAg是慢乙肝免疫發(fā)病機制的主要因素，HBV感染的慢性化與T、B細胞耗竭有關(guān)。理論上，HBsAg清除能促進免疫功能異常的恢復(fù)，這也是臨床治愈的表現(xiàn)之一，進而促進殘留病毒的清除，包括cccDNA和整合HBVDNA。

宿主細胞的免疫功能對HBV清除和HBV感染的預(yù)后有重要影響。持續(xù)的HBsAg清除和HBsAb的出現(xiàn)表明機體對HBV免疫應(yīng)答良好，標(biāo)志著感染的完全和持續(xù)控制。HBsAg清除患者相比HBsAg陽性患者的CD4+和CD8+T細胞應(yīng)答更強。此外，HBsAg定量結(jié)合CD4+T細胞表達的CTLA-4、CD95和CD107a以及CD8+T細胞表達的TIM-3和HLA-DR是慢乙肝患者12個月內(nèi)HBsAg清除的潛在預(yù)測因子。

體液免疫抑制和消除HBV感染也引起了諸多關(guān)注。慢乙肝患者體內(nèi)B細胞的分化能力明顯增強，但增殖能力明顯減弱。與HBsAg陽性患者相比，HBsAg陰性患者的初始B細胞和漿細胞更多，記憶B細胞更少。在PegIFNα治療期間，當(dāng)年齡、性別、治療時間等其他因素完全匹配時，HBsAg陰性患者的總B細胞和血漿B細胞比例高于HBsAg陽性患者。

04 血清HBsAg清除的持久性及對遠期結(jié)局的影響

臨床治愈通過最大限度地長期抑制HBV復(fù)制從而促進肝功能的恢復(fù)，特別是針對HBV的特異性免疫功能恢復(fù)，但不強調(diào)消除整合HBVDNA和cccDNA。目前，臨床治愈和完全治愈之間仍然存在差距。除了檢測整合HBVDNA和cccDNA外，停藥后臨床治愈的持續(xù)時間和遠期結(jié)局改善也很重要，這些在一定程度上可以反映完全治愈。

無論是自發(fā)性還是通過抗病毒治療獲得的HBsAg清除均表現(xiàn)出良好的持久性。陳新月教授的一項前瞻性研究分析了238例接受（Peg）IFNα單藥或聯(lián)合NAs治療獲得HBsAg清除的患者，在78周、104周、597周的HBsAg清除維持率分別為93.12%、91.82%和90.34%。中國香港和美國國立衛(wèi)生研究院的長期隨訪研究也發(fā)現(xiàn)，自發(fā)或藥物治療后獲HBsAg清除患者的臨床治愈率可維持在95%以上。此外，慢乙肝患者獲得HBsAg清除后的臨床預(yù)后也得到了明顯改善。2021年發(fā)表的一項系統(tǒng)綜述共納入188,316例慢乙肝患者，結(jié)果顯示HBsAg清除組和HBsAg陽性組終末期肝病的總發(fā)生率分別為0.19和2.45/1000人·年；HBsAg清除組發(fā)生終末期肝病、失代償期肝硬化、肝癌、肝移植和/或全因死亡的綜合RR值分別為0.31（95%CI,0.23-0.43;P<0.001）、0.28（95%CI,0.13-0.59;P=0.001）、0.30（95%CI,0.20-0.44;P<0.001）和0.22（95%CI,0.13-0.39;P<0.001）；對各種治療方案例如IFNα、NA或IFNα+NA的分層分析未發(fā)現(xiàn)亞組間終點事件風(fēng)險的顯著差異。更多有關(guān)HBsAg清除持久性及遠期結(jié)局的研究見下表。

HBsAg清除的持久性和遠期結(jié)局

05 HBsAg作為臨床治愈的指標(biāo)優(yōu)于其他生物標(biāo)志物

血清HBVRNA主要來源于pgRNA，被核衣殼包裹的pgRNA未啟動逆轉(zhuǎn)錄就釋放到細胞外從而產(chǎn)生HBVRNA病毒樣顆粒。然而，HBVRNA僅表明cccDNA的存在和轉(zhuǎn)錄活性，未能反映整合HBVDNA的活性。因此，在研究HBsAg與血清HBVRNA的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，只有在HBeAg陽性的初治慢乙肝患者中，血清HBsAg與血清HBVRNA具有顯著關(guān)聯(lián)；在HBeAg陰性慢乙肝患者和接受NAs或IFNα治療的患者中，相關(guān)性大大減弱。此外，HBVRNA的檢測方法不夠規(guī)范，容易受到HBVpgRNA剪接變體和HBVDNA的影響。

乙型肝炎病毒核心相關(guān)抗原（HBcrAg）由HBVpre-C/C區(qū)基因編碼的三種抗原組成，包括HBcAg、HBeAg和p22蛋白質(zhì)，相對分子量為22kD。血清HBcrAg作為cccDNA和HBV翻譯的標(biāo)志物，與肝內(nèi)cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)，可以監(jiān)測靶向cccDNA的新治療方案的療效。

基于HBV的生命周期和各種標(biāo)志物的來源，HBsAg不同于HBVRNA和HBcrAg。HBsAg揭示了cccDNA和整合HBVDNA的轉(zhuǎn)錄活性。因此，HBsAg持續(xù)陰性更接近于慢乙肝患者的完全治愈。目前追求臨床治愈的治療方案主要以IFNα為主。IFNα可以作用于cccDNA，甚至被認為是最有希望消除cccDNA的藥物之一。此外，IFNα通過組蛋白的表觀遺傳修飾調(diào)控cccDNA的轉(zhuǎn)錄，并通過APOBEC3家族蛋白間接靶向cccDNA。

06 獲得持續(xù)血清HBsAg清除患者的管理

臨床治愈的慢乙肝患者肝硬化和終末期肝病的發(fā)生率顯著降低，但仍然存在肝癌發(fā)生的風(fēng)險。除HBV因素外，肝癌發(fā)生與年齡、性別、家族史、肝硬化、治療方案（NAs或IFNα）、整合HBVDNA、合并感染、肥胖、糖尿病以及其他并發(fā)癥有關(guān)。HBsAg清除后男性、存在肝硬化史和肝癌家族史的患者肝癌發(fā)生風(fēng)險更高。HBsAg清除時的年齡、潛在肝硬化、肝癌家族史和過度飲酒都是肝癌發(fā)生的獨立預(yù)測因素。因此，即使在HBsAg清除后仍應(yīng)繼續(xù)進行肝癌監(jiān)測。

07 高靈敏度HBsAg檢測的必要性及其作為完全治愈標(biāo)志的可能性

血清HBsAg來源于cccDNA和整合HBVDNA。理論上，持續(xù)的HBsAg清除表明cccDNA和整合HBVDNA的活性受到抑制。

但在HBsAg清除的慢乙肝患者的肝臟中仍然可以檢測到整合HBVDNA和cccDNA，在隱匿性HBV感染（OBI）患者的血液或肝臟中也可以發(fā)現(xiàn)HBVDNA。2018年OzekiI等研究中招募了114例使用常規(guī)酶聯(lián)免疫分析法檢測不到HBsAg的慢乙肝患者，其中一半采用高靈敏度HBsAg檢測（定量下限0.005IU/mL）為陽性；2022年YuenMF等研究中800例常規(guī)檢測HBsAg清除的慢乙肝患者經(jīng)ArchitectHBsAgNext定性分析（AbbottLaboratories,AbbottPark,IL,USA）7.3%為陽性。高靈敏度HBsAg分析可以檢測出極低水平的HBsAg的存在。

在傳統(tǒng)市售檢測方法中，HBsAg的檢測下限介于0.03-0.05IU/mL之間。高靈敏度HBsAg定量檢測的檢測下限可達0.005IU/mL，除了檢測游離的HBsAg外，還能檢測抗原-抗體復(fù)合物，甚至突變的HBsAg。ArchitectHBsAgNext定性分析對HBV基因型A-H以及常見突變體的檢測具有一致的靈敏度。超高敏HBsAg定量檢測的檢測下限為0.0005IU/mL，比傳統(tǒng)HBsAg測定法低100倍。

臨床治愈后，HBsAg可能以低或極低的水平存在，這與停藥后肝病的復(fù)發(fā)和進展有關(guān)。通過高敏或超高敏HBsAg定量檢測對確認真正的治愈非常重要。臨床治愈意味著cccDNA的消除或持續(xù)失活，持續(xù)HBsAg清除也可以反映整合HBVDNA的顯著減少或清除。此外，HBsAg清除可刺激和恢復(fù)HBV特異性免疫，促進HBV感染的完全消除。結(jié)合臨床治愈的持久性和肝病臨床結(jié)局的顯著改善，高敏或超高敏定量HBsAg的持續(xù)清除可能反映了慢乙肝的完全治愈。

常規(guī)和高敏HBsAg定量檢測的特征

總結(jié)

完全治愈意味著cccDNA和整合HBVDNA的持續(xù)失活，而非HBV基因組的完全消除。HBsAg水平反映了cccDNA和整合HBVDNA的轉(zhuǎn)錄活性，在某種程度上，高敏或超高敏定量HBsAg的持續(xù)清除可能代表了慢乙肝患者的完全治愈。此外，HBV抗原，尤其是HBsAg，參與了慢乙肝的免疫發(fā)病機制。因此，HBsAg清除可以恢復(fù)異常的免疫功能，反過來又進一步促進殘留病毒包括cccDNA和整合HBVDNA的清除。

仍有一些問題需進一步解決：首先，持續(xù)的HBsAg清除是否意味著cccDNA和整合HBVDNA的完全失活。其次，越來越多的抑制HBV和提高宿主免疫應(yīng)答的新藥正在臨床試驗中，這些新藥的有效性、安全性以及完全治愈的最佳治療策略仍需大量探索。由于整合HBVDNA仍能表達HBsAg，HBsAg水平不能反映一些抑制或清除cccDNA的新藥的療效。第三，與無癥狀HBV攜帶者相比，肝癌/肝硬化患者存在更多的HBsAg突變體。盡管針對HBsAg突變體專門優(yōu)化了一組抗體，但定性免疫分析可能會對帶有突變HBsAg的HBV產(chǎn)生假陰性結(jié)果。最后，由于HBV相關(guān)肝癌的許多危險因素，HBsAg清除后仍有可能（極低）發(fā)生包括肝癌在內(nèi)的終末期肝病，因此仍需定期監(jiān)測。

肝霖君有話說

研究證實，高敏HBsAg檢測法比傳統(tǒng)檢測法可更早檢測到隱匿性HBV感染者的HBsAg，使HBsAg檢出率提高5-7%（相關(guān)鏈接）；經(jīng)高敏HBsAg檢測法發(fā)現(xiàn)常規(guī)檢測獲得HBsAg清除后仍發(fā)生肝癌的慢乙肝患者實際仍為HBsAg或HBcrAg陽性（相關(guān)鏈接）。因此我們推測達到更高敏HBsAg檢測的HBsAg清除后，肝炎復(fù)發(fā)、肝癌等不良臨床結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險都將進一步降低，甚至為0。

完全治愈以cccDNA和整合HBVDNA清除為目標(biāo)，可通過基因編輯技術(shù)來實現(xiàn)，但目前相關(guān)藥物均處于臨床前研究階段，可能需要更長的時間等待。PegIFNα可通過直接抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的雙重作用實現(xiàn)慢乙肝的臨床治愈，現(xiàn)有多項研究發(fā)現(xiàn)IFNα也可通過改變組蛋白的修飾等表觀遺傳學(xué)方式、經(jīng)巨噬細胞分泌外泌體攜帶的miRNA的作用以及促進ISG20與APOBEC3A的共表達等來清除cccDNA（相關(guān)鏈接一、二）。鑒于HBsAg來源于cccDNA和整合HBVDNA，基于PegIFNα治療獲得高靈敏度定量的HBsAg持續(xù)清除也將更接近完全治愈。完全治愈是我們追求的最終目標(biāo)，它可能需要NAs聯(lián)合一個有效的免疫調(diào)節(jié)類藥物，甚至是再聯(lián)合一個降低抗原水平藥物的三聯(lián)療法來實現(xiàn)。

參考文獻：

WangZL,ZhengJR,YangRF,etal.AnIdealHallmarkClosesttoCompleteCureofChronicHepatitisBPatients:High-sensitivityQuantitativeHBsAgLoss.JClinTranslHepatol2022.doi:10.14218/JCTH.2022.00289.

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