HepDART 2019：Spring Bank披露兩款全新在研乙肝新藥研究數據

全世界有超過2.5億的慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者，鑒于慢性乙型肝炎患者之間存在很大的異質性，目前尚缺乏有效的、安全的可實現功能性治愈慢乙肝的聯合療法。

為了實現這一目標，Spring Bank Pharmaceuticals 公司研究人員設計了一款可靶向所有HBV病毒轉錄物的新型嵌合反義寡核苷酸（CASOs），是通過將免疫調節劑二核苷酸SB9000（Inarigivir 的活性代謝物，Inarigivir 是一種口服的肝選擇性RIG-I激動劑，目前正在慢乙肝患者中進行全球Phase II期臨床試驗。）跟可切割的連接體與反義寡核苷酸(ASO)進行鏈接而成。

研究假設，這種將基因沉默和免疫調節相結合生成的嵌合反義寡核苷酸（CASOs）雙管齊下的方法可同時抑制 HBV DNA，RNA 和抗原產生，并在體內激活RIG-I，從而在慢乙肝患者中實現由免疫介導的病毒清除。

研究人員（a）使用標準的亞磷酰胺化學方法合成了一系列具有糖基和堿基修飾，并且是可針對 HBx RNA 不同區域的含有 8 至 20 個硫代磷酸酯的鏈接或沒有鏈接SB 9000的反義寡核苷酸(ASO)。

（b）為篩選熒光素酶報道基因，研究人員將HBx基因克隆到海腎和螢火蟲熒光素酶psiCHECK?-2雙重載體（Promega）中。將反義寡核苷酸(ASO)與質粒一起轉染到Hepa 1-6細胞中，并在24小時后測量熒光素酶活性。

（c）使用標準方案測試反義寡核苷酸(ASO)的血清穩定性和RNase H介導的互補RNA裂解。

抗HBV測定：（i）HepG2.2.15細胞：在脂質轉染反義寡核苷酸(ASO)后，在HepG2.2.15 細胞中評估了反義寡核苷酸(ASO)的抗病毒活性。通過點印跡雜交（dot-blot hybridization）監測細胞外 HBV DNA 水平，并通過中性紅色染料攝取評估毒性。

（ii）原代人肝細胞（PHH）：在第1天轉染反義寡核苷酸(ASO)，并在第二天用HBV（基因型D，MOI 500）感染細胞。 感染后第11天收集培養上清液和細胞，以定量HBV DNA（qPCR）和 HBsAg，HBeAg（ELISA）。

研究結果

使用螢光素酶測定法鑒定出了有效的嵌合反義寡核苷酸（CASOs），在 0.--5 nM 時表現出大于 75％ 的敲低。 通常，嵌合反義寡核苷酸（CASOs） 的效力比不含 SB 9000 的相應反義寡核苷酸(ASO)效力高約10倍。與25％血清溫育后，SB 9000 在6小時內從 CASO 上解離，所得的反義寡核苷酸(ASO)對核酸酶降解的抵抗能力長達48小時。

反義寡核苷酸(ASO)還顯示出強大的 RNaseH 介導的互補RNA裂解。

在HepG2.2.15細胞中，兩個先導嵌合反義寡核苷酸（CASOs） SB 527 和 SB 539 降低了 HBV DNA水平，EC50值在 10 至 99 nM 之間（CC50> 500 nM）。

此外，SB 527 和 SB 539 在 PHH 分析中僅以低納摩爾 EC50 即可促使 HBV DNA 和病毒抗原（HBsAg和HBeAg）顯著降低。 SB 527 和 SB 539 的目標 mRNA 區與HBV基因型A-H的同源性> 98％。

綜上，研究發現這兩款主要的嵌合反義寡核苷酸（CASOs） SB 527 和 SB 539 通過 RNase H 介導的機制敲低HBV病毒轉錄物，在基于細胞的測定中被發現是有效的抗HBV藥物。 目前研究人員正在進行進一步的研究以開發主要的嵌合反義寡核苷酸（CASOs），從而寄希望能以聯合療法提高慢乙肝的功能性治愈率。（更多肝病新藥研究信息敬請關注“肝臟時間”微信公眾號）！

信息來源HepDART 2019大會論文集：Antisense oligonucleotides linked to the immunomodulatory dinucleotide SB 9000 are highly potent anti-HBV agents