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編者按：目前用于治療HBV感染的抗病毒藥物主要包括核苷和干擾素α兩大類，兩者合理聯用已可以實現臨床治愈。乙肝的完全治愈（包括cccDNA和整合HBV DNA的清除）還無法實現，實現完全治愈主要有兩種策略：一是通過安全清除受感染的肝細胞，這需要通過誘導免疫調節(jié)來實現；二是通過清除cccDNA或永久沉默cccDNA轉錄。因此，基因編輯類藥物也成為了研發(fā)熱點，當然機會和風險是并存的，基因編輯類藥物研發(fā)的難度也大，目前都僅在臨床前研究階段。

2022年9月，Beam Therapeutics在2022國際HBV會議上公布了在研乙肝基因編輯類新藥胞嘧啶堿基編輯器（CBE）的完整臨床前數據，CBE通過靶向cccDNA和整合HBV DNA可有效降低病毒生物標志物并防止病毒反彈。

技術背景

01 堿基編輯策略通過在HBV基因組中引入終止密碼子實現HBV治愈

CBE可以靶向HBV基因組的cccDNA和整合HBV DNA，在不引起雙鏈DNA斷裂（DSB）的情況下將特定DNA堿基直接、不可逆地轉化為另一個堿基，從而引入精確和永久的終止密碼子/錯義突變，在達到沉默HBV基因的同時最大限度地減少染色體重排/缺失風險。

基于堿基編輯技術可以解決慢乙肝的兩個關鍵問題：1) 通過在cccDNA中引入永久性突變防止HBV反彈；2) 在無DSB的情況下，不可逆地沉默來源于整合HBV DNA的HBsAg表達。

02 CBE無需雙鏈斷裂即可將C-G轉換為T-A

轉換步驟：A：從DNA序列的目標堿基對C : G開始；B：CBE由部分失活的CRISPR蛋白與脫氨酶融合而成，經向導RNA（gRNA）引導至目標基因組的DNA序列上并暴露出狹窄的編輯窗口；C：脫氨酶通過脫氨作用將靶胞嘧啶（C）化學修飾為尿嘧啶（U），Cas酶則在相反鏈上形成切口；D：尿嘧啶（U）被DNA聚合酶解讀為胸腺嘧啶（T），修復DNA鏈缺口，完成C : G到T : A堿基對的轉換。

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C-G轉換為T-A

臨床研究結果

01 BE4/gRNAs（S1 + C2）有效降低細胞模型中HBV相關標志物并防止病毒反彈

BE4/gRNAs（S1 + C2）包含兩個gRNA，可引導堿基編輯器BE4同時靶向HBs（gRNA S1）和PreCore（gRNA C2）并在其DNA中引入終止密碼子。在HBV感染的人肝癌HepG2-NTCP細胞中，相比靶向無關基因PCSK9的BE4，BE4/gRNAs（S1 + C2）可導致HBV相關標志物（HBsAg、HBeAg、HBV DNA、3.5kb RNA）的大幅降低；BE4/gRNAs（S1 + C2）聯合拉米夫定可使堿基編輯率提高20%，對HBV相關標志物的抑制作用更明顯。進一步研究表明，BE4/gRNAs（S1 + C2）通過編輯cccDNA發(fā)揮作用，并不降低cccDNA水平。

堿基編輯治療可降低HepG2-NTCP細胞中HBV相關標志物

在原代肝細胞（PHH）中使用HBV DNA qPCR技術評估HBV病毒的復制，發(fā)現停用拉米夫定會導致HBV反彈，而停用BE4/gRNAs（S1 + C2）可防止病毒反彈。通過對cccDNA富集樣本的堿基編輯率進行評估，發(fā)現經BE4/gRNAs（S1 + C2）處理后約55%的HBs和80%的PreCore基因被成功編輯。

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不同藥物停藥后HBV DNA水平的變化

02 BE4/gRNA S1抑制自然整合HBV DNA的HBsAg表達

PLC/PRF/5細胞系是具有自然整合HBV DNA的肝癌細胞系，在第1天轉染BE4 mRNA和gRNA S1，第7天測定細胞外HBsAg水平。結果顯示BE4/gRNA S1可使約50%的HBs基因被編輯，細胞外HBsAg水平大幅降低。

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堿基編輯治療降低自然整合HBV DNA的HBsAg表達

03 BE4/gRNAs（S1 + C2）導致HBV小鼠模型中病毒標志物的持續(xù)減少

HBV小鼠接受脂質納米顆粒（LNP）遞送的BE4/gRNAs（S1 + C2）1劑或2劑作為試驗組，BE4/PCSK9 1劑或2劑以及恩替卡韋口服兩周作為對照組。在第一次注射后第35天：BE4/gRNAs（S1 + C2）治療組HBsAg平均下降> 2 log，9只小鼠中有6只的HBsAg降至檢測限以下；BE4/gRNAs（S1 + C2）治療組血清HBV DNA持續(xù)降低> 3 log，2劑相比1劑對HBV DNA的抑制作用更強，停藥后未觀察到反彈；恩替卡韋治療也能抑制HBV DNA的復制，但停藥后DNA水平立即反彈；BE4/gRNAs（S1 + C2）治療組所有小鼠在第一次注射后兩周HBeAg水平降至最低檢測限以下。

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堿基編輯治療持續(xù)降低HBV小鼠模型中的病毒標志物

總結

經雙重堿基編輯技術在HBV基因HBs和PreCore中引入終止密碼子可有效降低細胞及小鼠模型中HBV相關標志物如HBsAg、HBeAg、HBV DNA和3.5kb RNA水平，防止停藥后HBV的再激活。堿基編輯治療可能通過引入阻止HBV復制和沉默病毒蛋白表達的堿基突變，永久滅活cccDNA和整合HBV DNA，為實現慢乙肝的完全治愈帶來新的希望。

肝霖君有話說

由于HBV感染宿主后形成的cccDNA十分穩(wěn)定，且部分HBV DNA能整合到人類基因組中，導致對HBV的完全清除十分困難，慢乙肝的完全治愈至今未能實現。而基因編輯技術能直接靶向致病基因，在治愈許多難治性疾病包括慢乙肝方面展現出了巨大潛力。

目前針對慢乙肝的基因編輯藥物共有3個，均長期處于臨床前研究階段。基因編輯藥物的研發(fā)同時也充滿了挑戰(zhàn)。首先是基因編輯效率問題，我們需要將基因編輯所需要的蛋白質、酶、mRNA、gRNA等特異性遞送至受感染的肝細胞，繼而產生堿基轉換、基因敲入/敲除等以修復或沉默致病基因。但現有遞送載體的傳遞效率低下、載體容量小、靶向特異組織能力不足、基因編輯的工具酶效率低等都會導致基因編輯效率低，部分致病基因未能實現編輯從而無法完全清除病毒基因組，如本文中BE4/gRNA的堿基編輯率在50% - 80%之間，未實現100%編輯，進而也未實現對所有研究對象HBsAg的徹底清除。其次是脫靶效應，即除了編輯目標基因以外，還可能識別非目標區(qū)域但具有相似堿基序列的基因進行編輯，從而改變正常的基因組。人類大約有2 - 3萬個基因，但整個基因組間的差異不足1%。要在如此多的基因中實現對特定基因的編輯難度較高，基因編輯的脫靶率也較高，從而引發(fā)一系列的不良反應，嚴重時甚至可能危及生命，且目前也缺少能在全基因組范圍內檢測脫靶的高靈敏方法，所以安全性將是阻礙基因編輯藥物發(fā)展的另一大難題。此外，基因編輯作為一種新興技術，目前還處于早期發(fā)展階段，基因編輯策略的優(yōu)化和過程控制都還需進一步探索，前期藥物開發(fā)的經驗也十分匱乏，故相比傳統(tǒng)藥物在開發(fā)周期、人力、物力等方面耗費更多，推進也更難。

盡管基因編輯療法的開發(fā)困難重重，現階段人們對基因編輯技術的爭議頗多，但相信隨著眾多科研人員的深入研究與打磨，基因編輯有望被有效而安全地運用于治病救人，造福世界。

在目前完全治愈還無法實現的情況下，應積極追求臨床治愈以最低化遠期不良結局風險，而不能盲目的等待新藥的上市。最近也有相關研究發(fā)現相當一部分臨床治愈的慢乙肝患者實現肝內cccDNA清除，HBV整合顯著降低（相關鏈接）。因此是否通過更高敏的HBsAg檢測手段可以讓臨床治愈更接近完全治愈，這也是目前積極探索的課題（相關鏈接）。

參考文獻：

Smekalova E, Martinez MG, Combe E, et al. Cytosine base editing inhibits Hepatitis B Virus replication and reduces HBsAg expression in vitro and in vivo. 2022 International HBV Meeting.

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